Navoximod moduliert das lokale HSV

Dec 30, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 621 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die onkolytische Virotherapie kann zur Tumorlyse und systemischen Antitumorimmunität führen, das therapeutische Potenzial beim Menschen ist jedoch aufgrund der beeinträchtigten Virusreplikation und der unzureichenden Fähigkeit, die immunsuppressive Tumormikroumgebung (TME) zu überwinden, begrenzt. Um die oben genannten Probleme zu lösen, haben wir festgestellt, dass der Indolamin-2,3-Dioxygenase-1 (IDO1)-Inhibitor Navoximod die Replikation des Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) und die HSV-1-vermittelte Onkolyse in Tumorzellen fördert, was ihn zu einer vielversprechenden Kombinationsmodalität macht mit HSV-1-basierter Virotherapie. Daher haben wir HSV-1 und Navoximod zusammen in ein injizierbares und biokompatibles Hydrogel (V-Navo@gel) für die Virotherapie des hepatozellulären Karzinoms (HCC) geladen. Das Hydrogel bildete ein lokales Abgabereservoir, um die Virusreplikation und -verteilung an der Tumorstelle mit einer Einzeldosis-Injektion zu maximieren. Insbesondere verbesserte V-Navo@gel die krankheitsfreie Überlebenszeit von HCC-tragenden Mäusen und schützte die Mäuse vor einem Wiederauftreten des Tumors. Darüber hinaus zeigte V-Navo@gel auch im orthotopischen Leberkrebsmodell von Kaninchen eine wirksame therapeutische Wirksamkeit. Mechanistisch haben wir außerdem herausgefunden, dass unsere Kombinationsstrategie das TME durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung vollständig neu programmierte. Alle diese Ergebnisse deuteten zusammengenommen darauf hin, dass die Kombination von Navoximod mit HSV-1 die Virusreplikation steigern und TME für die Tumorausrottung durch das Hydrogelreservoir umformen könnte.

Dank des Erfolgs von Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) und der adoptiven Zelltherapie hat die Krebsimmuntherapie (CIT) in den letzten Jahren bei mehreren Krebsarten bemerkenswerte Erfolge erzielt1. Als fünfthäufigster Krebs weltweit stößt die Immuntherapie des hepatozellulären Karzinoms (HCC) aufgrund der komplexen immunologischen Mikroumgebung mit starken immunsuppressiven Wirkungen auf große Hindernisse wie niedrige Ansprechraten und unerwünschte klinische Ergebnisse2,3,4. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung anderer Immuntherapiestrategien für HCC, um diese Hindernisse zu überwinden. Die onkolytische Virotherapie hat sich seit der Zulassung von T-VEC, einem genetisch veränderten Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1), durch die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) zur Melanombehandlung in vielen präklinischen und klinischen Studien als vielversprechende Therapie erwiesen im Jahr 20155,6. Im Gegensatz zur Immun-Checkpoint-Blockade, die eher auf der Modulation des TME beruht, beeinflussen onkolytische Viren nicht nur das TME, um eine Anti-Tumor-Immunität zu induzieren, sondern ermöglichen auch einen direkten Angriff und die Abtötung von Krebszellen7. Dennoch erfordern die dauerhafte Remissionsrate von 16 % bei mit T-VEC behandelten Melanompatienten und die unerwünschten klinischen Ergebnisse bei soliden Tumoren dringende Anforderungen an eine weitere Optimierung der Virotherapie8,9. Die begrenzten therapeutischen Wirkungen werden hauptsächlich durch zwei Gründe verursacht: die immunsuppressive Tumormikroumgebung und die antivirale Immunität, durch die das Immunsystem die Virusinfektion bekämpft10. Allerdings konkurrieren die Aktivierung der Antitumorimmunität und die Unterdrückung der antiviralen Immunität bei der TME miteinander und erfordern eine sorgfältige Modulation, um das Gleichgewicht zwischen ihnen für eine optimierte Virotherapie aufrechtzuerhalten.

Indolamin 2, 3-Dioxygenase 1 (IDO1) ist ein wichtiges immunsuppressives Protein, das nachweislich bei mehreren Tumorarten hochreguliert ist11,12. Durch die Katalyse von Tryptophan (Trp) zu Kynurenin (Kyn) hemmt IDO1 die Aktivitäten von CD8+-T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK), verbessert die Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg) und erleichtert die Rekrutierung myeloider Suppressorzellen (MDSCs). )13,14. Dementsprechend wurden IDO1-Inhibitoren in mehreren präklinischen und klinischen Studien getestet und haben sich als wirksame Strategie für die Immuntherapie erwiesen15,16. In dieser Studie fanden wir heraus, dass die Behandlung mit HSV-1 zu einer Hochregulierung der IDO1-Expression in HCC-Zellen führen könnte, was darüber hinaus als negativer Rückkopplungsmechanismus des Immunsystems wirkte, um die HSV-1-Replikation im Tumor zu begrenzen. Daher könnte die Hemmung von IDO1 während der HSV-1-Virotherapie eine doppelte Rolle spielen, indem sie das immunsuppressive TME moduliert und die Virusreplikation in den Tumorzellen verstärkt. Dies lieferte uns die Begründung, den IDO1-Inhibitor Navoximod mit der onkolytischen HSV-1-Virotherapie zur HCC-Behandlung zu kombinieren.

Um eine lokale Wirkstofffreisetzung und eine maximale Virusverteilung an der Tumorstelle zu erreichen, haben wir HSV-1 und Navoximod in injizierbare Seidenhydrogele (bezeichnet als V-Navo@gel) eingekapselt (Abb. 1). Wir haben gezeigt, dass die Seidenhydrogele ein lokales Abgabereservoir bilden, in dem HSV-1 eine zufriedenstellende zytotoxische Fähigkeit und Verteilung an der Tumorstelle aufrechterhält und in der Zwischenzeit die Off-Target-Schäden an den peripheren Organen abschwächt. Unsere Strategie führte zu vollständigen therapeutischen Reaktionen von subkutanen HCC-Tumoren, verglichen mit nur teilweisen Reaktionen, die mit HSV-1 oder einer HSV-1/Navoximod-Mischung ohne Beladung in den Hydrogelen erzielt wurden. Darüber hinaus nutzten wir die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq), um die Infiltration von Immunzellen an die Tumorstelle genau zu profilieren, und zeigten, dass V-Navo@gel dem immunsuppressiven TME entgegenwirken kann, indem es Immunzellpopulationen umgestaltet, die von der Akkumulation von Effektor T dominiert werden Zellen und NK-Zellen. Das positive Ergebnis könnte sich auch auf das orthotopisch implantierte VX-2-Lebertumormodell beim Kaninchen ausweiten. Gemeinsam haben wir gezeigt, dass die Kombination von Navoximod mit HSV-1 die Wirksamkeit der onkolytischen Virotherapie durch das Hydrogelreservoir steigert, und liefern damit Belege für den Einsatz dieser Strategie für klinische Untersuchungen.

Nach intratumoraler Injektion könnten Hydrogele HSV-1 an der Tumorstelle begrenzen, um die systemische Toxizität zu verringern. HSV-1 könnte an der Tumorstelle die Expression des immunsuppressiven Proteins IDO1 induzieren, was die therapeutische Wirkung beeinträchtigt. Die Freisetzung von Navoximod aus V-Navo@gel könnte daher die enzymatische Aktivität von IDO1 hemmen und anschließend gleichzeitig die Virusreplikation und die Antitumor-Immunantworten verstärken.

Da die Clearance von HSV-1 durch antivirale Immunität eines der Haupthindernisse für die HSV-1-basierte Virotherapie darstellt, haben wir die Gene untersucht, die die HSV-1-Replikation unter den Interferon-stimulierten Genen (ISGs) hemmen, die die Hauptakteure sind der antiviralen Immunität zur Optimierung der HSV-1-basierten Virotherapie. Wir fanden heraus, dass die Überexpression von IDO1, einem der gemeldeten ISGs17, die HSV-1-Replikation inhibierte, dargestellt durch die Spiegel des Hüllglykoproteins gD (Abb. 2a) und der genomischen DNA von HSV-1 (angezeigt durch gD und ICP47-DNA, Abb. 2b). ). In der menschlichen HCC-Zelllinie SMMC-7721 und der Maus-Brustkrebszelllinie 4T1 wurden übereinstimmende Ergebnisse erzielt, wonach die Überexpression von IDO1 die HSV-1-Replikation inhibierte, was auf die Universalität unserer Ergebnisse schließen lässt (ergänzende Abbildung 1a, b). Darüber hinaus verwendeten wir das von GFP-markiertem HSV-1 erzeugte GFP-Signal als weiteren Index der HSV-1-Replikation, und es wurde beobachtet, dass die GFP-Intensität in IDO1-überexprimierenden Zellen viel geringer war als die in Wildtyp-Zellen nach einer HSV-1-Infektion ( Abb. 2c). Es wurde berichtet, dass IDO1 bei mehreren Krebsarten überexprimiert wird15, und wir haben auch bestätigt, dass es in HCC-Tumorgeweben hochreguliert ist, gemäß dem RNA-Seq-Datensatz des Cancer Genome Atlas (TCGA) und den RNA-Seq-Ergebnissen unserer Gruppe (Abb . 2d). Bemerkenswerterweise zeigten qPCR und Western Blot auch, dass die Behandlung mit HSV-1 die Hochregulierung der IDO1-Expression in Hepa1-6-Zellen sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene induzieren könnte (Abb. 2e und ergänzende Abb. 1c). Somit wurde IDO1 in HCC-Geweben überexprimiert und konnte durch HSV-1-Behandlung weiter hochreguliert werden, was als negativer Rückkopplungsmechanismus des Immunsystems wirkte, um die HSV-1-Replikation in den Tumorzellen zu begrenzen. Zusammen mit den früheren Berichten, dass IDO1 immunsuppressiv gegen die Antitumorimmunität ist, waren wir der Ansicht, dass eine Notwendigkeit besteht, IDO1 während einer HSV-1-basierten Virotherapie zu blockieren.

Mit leerem Vektor (VT) oder Flag-markiertem IDO1-Konstrukt transfizierte a–c Hepa1-6-Zellen wurden 24 Stunden lang mit HSV-1 infiziert. eine Western-Blot-Analyse von gD, FLAG und GAPDH. b RT-qPCR-Analyse des DNA-Spiegels von gD (links) und ICP47 (rechts) (n = 3; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). c Repräsentative Fluoreszenzbildgebung (links) und Durchflusszytometrieanalyse (rechts) von GFP-positiven Hepa1-6-Zellen. Maßstabsbalken: 100 μm. n = 3. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM angezeigt. d Die IDO1-Expression in HCCs und ihren entsprechenden Peritumorgeweben wurde durch TCGA-HCC-Kohorte (links) und Transkriptomsequenzierung (rechts) bestimmt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM angezeigt. e Hepa1-6-Zellen, die 12 Stunden lang mit 20 MOI HSV-1 infiziert waren, wurden mittels RT-qPCR auf IDO1-mRNA-Spiegel analysiert (n = 3; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). f, g Hepa1-6-Zellen wurden mit 5 MOI HSV-1 oder 5 MOI HSV-1 plus 1 μM Navoximod (V-Navo) behandelt. f RT-qPCR-Analyse des gD- (links) und ICP47-DNA-Spiegels (rechts) zu den angegebenen Zeitpunkten (n = 3; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). g Western-Blot-Analyse von gD und GAPDH. h Die Zelllebensfähigkeit von Hepa1-6-Zellen mit den angegebenen Behandlungen wurde durch Durchflusszytometrieanalyse unter Verwendung von Annexin V-APC und PI-Färbung bestimmt (n = 2; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). i RT-qPCR-Analyse der intratumoralen genomischen HSV-1-DNA-Spiegel, dargestellt durch gD (links) und ICP47 (rechts), 8 Tage nach den angegebenen Behandlungen (n = 7; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt).

Navoximod ist ein hochselektiver IDO1-Inhibitor. Basierend auf den oben genannten Erkenntnissen, dass IDO1 die HSV-1-Replikation einschränken könnte, untersuchten wir als Nächstes, ob die gezielte Behandlung von IDO1 durch Navoximod die Hemmung der HSV-1-Replikation und die zytotoxischen Wirkungen umkehren könnte. Im Vergleich zur alleinigen HSV-1-Behandlung induzierte die HSV-1/Navoximod-Mischung (als V-Navo bezeichnet) eine dramatische Steigerung des genomischen DNA-Spiegels und des gD-Proteinspiegels von HSV-1, was darauf hindeutet, dass Navoximod die HSV-1-Replikation verbesserte ( Abb. 2f, g). Konsequenterweise haben wir weiter bestätigt, dass Navoximod die HSV-1-Replikation in SMMC-7721- und 4T1-Zellen verbessert (ergänzende Abbildung 1d, e). Wir untersuchten auch die Wirkung von zwei weiteren IDO1-Inhibitoren, Indoximod und Epacadostat, auf die HSV-1-Replikation. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Verbindungen in der Lage waren, die HSV-1-Replikation in Hepa1-6-Zellen zu steigern (ergänzende Abbildung 1f). Darüber hinaus verringerte die HSV-1/Navoximod-Mischung die Zelllebensfähigkeit von Hepa1-6-Zellen, was darauf hindeutet, dass Navoximod die HSV-1-vermittelte Onkolyse von HCC-Zellen verstärkte (Abb. 2h). Darüber hinaus zeigte das subkutane HCC- und 4T1-Mäusemodell, dass die intratumorale Injektion von Navoximod die HSV-1-Replikation an der Tumorstelle steigerte (Abb. 2i und ergänzende Abb. 1g). Insgesamt zeigten diese Daten, dass Navoximod die Replikation und die onkolytischen Wirkungen von HSV-1 sowohl in vitro als auch in vivo verstärken kann, was auf das Potenzial und die Vorteile der kombinatorischen Virotherapie mit HSV-1 und Navoximod schließen lässt.

Um die Virusverteilung auf Tumorzellen zu maximieren, haben wir aus Kokons erzeugte Seidenhydrogele als intratumorales Abgabesystem für Viren eingeführt (Abb. 3a)18. Die begrenzte Zytotoxizität und ausgezeichnete biologische Sicherheit von Seidenhydrogelen wurden erstmals in Hepa1-6-Zellen nachgewiesen (ergänzende Abbildung 2a). Als nächstes haben wir HSV-1 in Seidenhydrogele (Virus@gel) eingekapselt und seine biologischen Eigenschaften überprüft. Virus@gel zeigte injizierbare und gelatineartige Eigenschaften (Abb. 3b), die wichtige Eigenschaften für ein praktikables Hydrogel-Abgabesystem sind. Die poröse Netzwerkstruktur von Virus@gel und die Virionenverteilung innerhalb von Hydrogelen wurden durch Rasterelektronenmikroskopie bzw. konfokale Mikroskopie verifiziert (Abb. 3c, d und ergänzende Abb. 2b). Eine weitere Bewertung der rheologischen und Quelleigenschaften zeigte den Gelzustand von Virus@gel und das niedrige Quellverhältnis (ergänzende Abbildung 2c, d), was auf gute mechanische Eigenschaften und Materialstabilität hinweist.

a Das Bild des Lösung-zu-Gel-Prozesses von Seidengelen. b Das Bild von HSV-1, eingekapselt in den Seidenhydrogelen (Virus@gel), zeigte die Eigenschaften der Gelierung und Injizierbarkeit. c REM-Aufnahme von Virus@gel. d Konfokale 3D-Bildgebung von HSV-1, markiert mit DyLight 550 in Seidenhydrogelen. e, f Die Durchflusszytometrie-Analyse (e) und die repräsentativen Fluoreszenzbilder (f) von GFP-positiven Hepa1-6-Zellen im Experiment mit verzögerter Freisetzung. Maßstabsbalken: 100 μm. n = 3. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM angezeigt. g Die Zelllebensfähigkeit nach PBS-, PBS@gel-, HSV-1- oder Virus@gel-Behandlung wurde durch Durchflusszytometrieanalyse unter Verwendung von Annexin V-APC und PI-Färbung bestimmt (n = 3; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). h–j Mäusen mit Hepa1-6-Tumoren wurde intratumoral HSV-1 oder Virus@gel injiziert. h Die Akkumulation von DyLight 550-markiertem HSV-1 an der Tumorstelle zu den definierten Zeitpunkten. Rote Kreise zeigten die Tumorstellen an. Rote Pfeile zeigten die Diffusion des Virus außerhalb der Tumore an. i Die repräsentative Fluoreszenzbildgebung der gefrorenen Tumorschnitte 8 Tage nach der intratumoralen Verabreichung von HSV-1 oder Virus@gel. GFP-Signale deuteten auf mit HSV-1 infizierte Zellen hin. Maßstabsbalken: 100 μm. j RT-qPCR-Analyse der intratumoralen genomischen HSV-1-DNA-Spiegel, dargestellt durch gD, zu den definierten Zeitpunkten (n = 8; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt).

Wir haben außerdem gezeigt, dass die Seidenhydrogele die anhaltende Freisetzung der Virionen über einen Zeitraum von 7 Tagen unterstützen können (Abb. 3e, f, siehe ergänzende Abb. 2d). Der Zelllebensfähigkeitstest zeigte, dass Virus@gel nach 4-tägiger Kokultivierung mit Hepa1-6-Zellen 76,6 % des Zelltods verursachte, was auf eine ausgezeichnete onkolytische Wirkung von Virus@gel schließen lässt (Abb. 3g). Darüber hinaus zeigte der In-vivo-Tierversuch, dass in den Seidenhydrogelen beladenes HSV-1 3 Tage nach der Injektion nachgewiesen werden konnte, während das Signal von freiem HSV-1 an der Tumorstelle innerhalb von 3 Stunden schnell schwächer wurde, was bestätigt, dass sich Seidenhydrogele ausdehnen die lokalisierte Retention der Virionen an der Tumorstelle (Abb. 3h). Konsistent verstärkte Virus@gel das GFP-Signal von HSV-1 und den genomischen DNA-Spiegel von HSV-1 an der Tumorstelle im Vergleich zur alleinigen HSV-1-Behandlung (Abb. 3I, j). Die oben genannten Daten zeigten, dass unsere Seidenhydrogele die lokale Retention und Replikation des Virus an der Tumorstelle verbessern konnten.

Wir haben außerdem gezeigt, dass Seidenhydrogele die Virusdiffusion und -infektion in gesundes Gewebe verhindern, was durch den HSV-1-Genom-DNA-Spiegel im Nervensystem, im Blut und in peripheren Organen nach subkutaner Injektion von HSV-1 oder Virus@gel angezeigt wurde (Ergänzung). Abb. 3a, b). Die Blutbiochemie und die Routineindizes von Mäusen zeigten die begrenzte Toxizität von Virus@gel (ergänzende Abbildung 3c). H&E-Bilder der Hauptorgane zeigten in allen Gruppen durchweg vernachlässigbare Schäden (ergänzende Abbildung 3d).

Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Virus@gel, das eine geringe systemische Toxizität und eine gute biologische Sicherheit aufwies, die Virusverteilung und -replikation an der Tumorstelle drastisch maximieren konnte, was es zu einer potenziellen Verabreichungsplattform für die Virotherapie macht.

Basierend auf den oben genannten Erkenntnissen untersuchten wir als nächstes die Antitumorwirkung von V-Navo@gel (HSV-1/Navoximod-Mischung, eingekapselt in Seidenhydrogelen) im subkutanen HCC-Mausmodell. C57BL/6-Mäuse wurden subkutan mit Hepa1-6-Zellen geimpft und mit einer Einzeldosis PBS, HSV-1, HSV-1-beladenen Hydrogelen (Virus@gel), Navoximod-beladenen Hydrogelen (Navo@gel) und HSV-1 behandelt plus Navoximod-Mischung (V-Navo) bzw. V-Navo@gel (Abb. 4a). Von allen Gruppen zeigten mit V-Navo@gel behandelte Mäuse die stärkste hemmende Wirkung auf Tumore, was durch die Veränderung des Tumorvolumens (Abb. 4b – d) und der Überlebensrate (Abb. 4e) angezeigt wurde. Bei zwei von sechs mit V-Navo@gel behandelten Mäusen wurden die Tumoren vollständig ausgerottet und alle Mäuse dieser Gruppe überlebten 40 Tage nach der Tumorinokulation ohne offensichtliche Schwankungen des Körpergewichts (Abb. 4d – f). Konsistente Ergebnisse wurden im 4T1-Tumormodell erzielt, bei dem die Behandlung mit V-Navo@gel zu den stärksten hemmenden Wirkungen auf das Tumorwachstum ohne offensichtliche Schwankungen des Körpergewichts führte (ergänzende Abbildung 4). Die H&E-, Ki67- und TUNEL-Färbung des Tumorabschnitts zeigte, dass V-Navo@gel in allen Gruppen die schwerwiegendsten zytolytischen Schäden an Tumorgeweben verursachte (ergänzende Abbildung 5). Diese Ergebnisse bestätigten, dass V-Navo@gel das Wachstum von HCC-Tumoren wirksam verhindern und die Onkolyse von Tumorzellen induzieren kann.

ein Schema des therapeutischen Vorgehens. b, c Tumorvolumina von Mäusen mit den angegebenen Behandlungen. Die Zahl in den Klammern gab die objektive Tumoransprechrate (ORR) der Mäuse in jeder Gruppe nach dem gesamten Überwachungsprozess an (n = 6 Mäuse pro Gruppe; die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). d Von Mäusen isolierte Tumorbilder nach den angegebenen Behandlungen. e Die Überlebenskurven von Mäusen mit den angegebenen Behandlungen (n = 6; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). f Das Gewicht der inokulierten Mäuse änderte sich während der gesamten Messung (n = 6; die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). g Schema des Tumor-Rechallenge-Modells. h, i Tumorvolumina von Mäusen mit den angegebenen Behandlungen (n = 8; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). j Tumorbilder, die nach den angegebenen Behandlungen von Mäusen isoliert wurden. k Repräsentative FACS-Plots (gegatet auf CD4+- oder CD8+-Zellen) und der Prozentsatz von Tem (CD62LlowCD44high), Tcm (CD62LhighCD44high) und naiven T-Zellen (CD62LhighCD44low) wurden durch FACS untersucht (n = 3; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt) .

Als nächstes wurde eine Tumor-Re-Challenge-Studie durchgeführt, um festzustellen, ob V-Navo@gel HCC-geheilte Mäuse vor einem erneuten Auftreten des Tumors schützen kann (Abb. 4g). Während des 22-tägigen Beobachtungszeitraums blieben alle tumortragenden Mäuse, die erneut mit Hepa1-6-Zellen in der V-Navo@gel-Gruppe behandelt wurden, tumorfrei (Abb. 4h – j). Um die zugrunde liegenden Mechanismen des Schutzes vor Tumorrezidiven weiter zu entschlüsseln, analysierten wir die Häufigkeit naiver T-Zellen (CD62LhighCD44low), TCM (CD62LhighCD44high) und TEM (CD62LlowCD44high) sowohl von CD4+- als auch CD8+-T-Zellen in der Milz der Mäuse nach Rezidiven. Herausforderungsexperimente. Im Vergleich zur Kontrollgruppe verursachte V-Navo@gel eine Abnahme der naiven T-Zellen und des TCM, während es zu einem Anstieg der TEM sowohl der CD4+- als auch der CD8+-T-Zellen kam, was darauf hindeutet, dass V-Navo@gel eine Umwandlung vom naiven in das zentrale Gedächtnis induzierte T-Zellen zu Effektor-Gedächtnis-T-Zellen zur schnellen Beseitigung von Tumorrezidiven (Abb. 4k).

Um eine detailliertere und unvoreingenommene Analyse der Immunpopulation und der Tumor-Immun-Interaktion in den Tumoren von mit V-Navo@gel behandelten Mäusen durchzuführen, wurde PBS, Virus@gel oder V-Navo@gel intratumoral injiziert und die Tumoren einzeln dissoziiert -Zell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq), wenn es zu einer erheblichen Tumorregression, aber keiner vollständigen Eradikation kam. Wir verwendeten zunächst eine unbeaufsichtigte Clustering-Datenanalyse, um die gesamten Zellen in verschiedene Gruppen zu unterteilen, und Populationen von Tumorzellen, myeloischen Zellen, T-Zellen, NK-Zellen, Fibroblasten, Wandzellen und Fibroblasten wurden mit unterschiedlichen molekularen Signaturen identifiziert (ergänzende Abbildung 6a, B). Unter den tumorinfiltrierenden Immunzellen sind von Myeloiden abgeleitete Zellen und T/NK-Zellen die vorherrschenden Zellpopulationen (ergänzende Abbildung 6c), die anhand der kanonischen Marker für jede Population weiter klassifiziert wurden 19, 20, 21.

Anschließend führten wir ein unbeaufsichtigtes Clustering von T/NK-Zellen aus scRNA-seq in Kontroll-, Virus@gel- und V-Navo@gel-Gruppen durch. Es entstanden insgesamt acht Cluster, darunter vier Cluster für CD8+ T-Zellen, drei Cluster für CD4+ T-Zellen und ein Cluster für NK-Zellen, jeweils mit seinen einzigartigen Signaturgenen (Abb. 5a, b). Der Vergleich dieser Cluster zwischen PBS-, Virus@gel- und V-Navo@gel-Behandlung ist in Abb. 5c, d dargestellt. Bemerkenswert ist, dass die Population der NK-Zellen (Cluster T_6) nach der V-Navo@gel-Behandlung angereichert wurde. V-Navo@gel induzierte auch eine starke Anreicherung zytotoxischer CD8+-CTLs (Cluster T_3, mit Überexpression der zytotoxischen Marker Gzmf/d/e und Effektormarker Ifng/Nkg7) und zyklischer CD8+-CTLs (Cluster T_1 und T_2, mit Überexpression des Zellzyklus). und DNA-Replikationsmarker Cenpf/e, Top2a, Mki67, Npm1 und Rrm2). Der dramatische Anstieg der NK-Zellen und CD8+-T-Zell-Untergruppen mit funktionellen zytotoxischen und proliferierenden Genexpressionssignaturen erklärt die vielversprechende Wirksamkeit der Tumorausrottung durch die V-Navo@gel-Behandlung im subkutanen HCC-Mausmodell. Unterdessen wurden nach der V-Navo@gel-Behandlung auch T-Helferzellen (Cluster T_8) angereichert, die für die Anti-Tumor-Immunantwort von zentraler Bedeutung sind, indem sie Effektor-T-Zellen aktivieren und angeborene Immunzellen wie Makrophagen rekrutieren.

ein UMAP-Diagramm, das identifizierte Zellcluster innerhalb der T/NK-Population zeigt. b Blasen-Heatmap, die die Expression ausgewählter Signaturgene in jedem T/NK-Cluster zeigt. Die Blasengröße stellt den Prozentsatz der exprimierenden Zellen dar, gefärbt basierend auf normalisierten Expressionsniveaus. c Vergleich der T/NK-Zellcluster zwischen PBS-, Virus@gel- und V-Navo@gel-Behandlung. d Quantifizierung des Anteils jeder Zelltyppopulation basierend auf der Behandlung. e UMAP-Diagramm, das identifizierte Zellcluster innerhalb der von Myeloiden abgeleiteten Population zeigt. f Blasen-Heatmap, die die Expression ausgewählter Signaturgene in jedem myeloischen Cluster zeigt. Die Blasengröße stellt den Prozentsatz der exprimierenden Zellen dar, gefärbt basierend auf normalisierten Expressionsniveaus. g Vergleich myeloischer Zellcluster zwischen PBS-, Virus@gel- und V-Navo@gel-Behandlung.

Es wurde festgestellt, dass myeloische Populationen bei TME starke Auswirkungen auf die T-Zell-Immunität haben22,23, daher haben wir uns auch auf die Variation myeloischer Populationen nach V-Navo@gel-Virotherapie konzentriert. Die unbeaufsichtigte Anhäufung myeloischer Zellen ergab insgesamt elf Ansammlungen, darunter sieben für Makrophagen, einen für Monozyten und drei für DCs (Abb. 5e, f). Bemerkenswert ist, dass die Population von cDC1 (Cluster MD_10), von der berichtet wurde, dass sie sowohl CD4+- als auch CD8+-T-Zellen aktiviert und die T-Zell-vermittelte Antitumorimmunität direkt verstärkt24, durch die V-Navo@gel-Behandlung im Vergleich zur PBS-Gruppe angereichert wurde einzelne Virus@gel-Behandlung (Abb. 5g). Darüber hinaus beobachteten wir auch Veränderungen in den Makrophagenpopulationen (Abb. 5g). Zwei funktionelle Phänotypen der Makrophagen M1 und M2 sind seit langem etabliert, wobei M1-Makrophagen als Antitumor-Makrophagen gelten, während M2-Makrophagen zu pro-tumorigenen Ergebnissen beitragen. V-Navo@gel verursachte eine Anreicherung von Cluster-MD_3-Makrophagen mit starker Expression von M1-Signaturgenen, was darauf schließen lässt, dass M1-Makrophagen auch am durch V-Navo@gel vermittelten Antitumorprozess beteiligt waren (Abb. 5g und ergänzende Abb. 6d). . Die oben genannten Ergebnisse weisen insgesamt darauf hin, dass die V-Navo@gel-Virotherapie die myeloischen Populationen von cDC1- und M1-Makrophagen erhöht und somit die Antitumorwirksamkeit fördert.

Um den Einfluss des V-Navo@gels auf die biologischen Aktivitäten von Krebszellen weiter zu beurteilen, führten wir eine GO-Analyse der unterschiedlich exprimierten Gene in Krebszellen durch. Die GO-Analyse ergab eine Anreicherung des Zell-Chemotaxis-Prozesses durch die V-Navo@gel-Behandlung mit einer Hochregulierung der CCL- und CXCL-Unterfamilien, von denen zuvor bekannt war, dass sie die Rekrutierung, Differenzierung und Expansion von Immunzellen modulieren (Abb. 6a, b und ergänzende Abb. 7). . Um den Zusammenhang zwischen der Hochregulierung von Genen der CCL/CXCL-Familie und der von T-Zellen abgeleiteten Antitumorimmunität zu untersuchen, wurde CellularDB durchgeführt, um die Kommunikation von Krebszellen und T-Zellen zu analysieren. Die Ligand-Rezeptor-Analyse ergab, dass CCL2/CCR2, CXCL10/CXCR3 und CXCL11/CXCR3 die wichtigsten Interaktionsmodule zur Vermittlung des Crosstalks zwischen Krebszellen und verschiedenen Populationen von T-Zellen waren (Abb. 6c) und die Interaktionen dieser Ligand-Rezeptor-Paare verstärkten zwischen Krebszellen und T-Zellen wurden beobachtet (Abb. 6d). Somit deuten die oben genannten Daten darauf hin, dass die V-Navo@gel-Behandlung neben der Beeinflussung der Immunzellpopulationen auch auf Krebszellen wirkt, indem sie die Rekrutierung von T-Zellen an den Tumorstellen moduliert.

a, b Top-10-Begriffe in der Genontologie (GO)-Analyse unterschiedlich exprimierter Gene in der V-Navo@gel-Gruppe im Vergleich zur PBS-Gruppe (a) und in der V-Navo@gel-Gruppe im Vergleich zur Virus@gel-Gruppe (b). c Überblick über Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und verschiedenen T-Zell-Clustern. Die Blasengröße stellt den p-Wert dar. Die Farbe stellt den Mittelwert des durchschnittlichen Ausdrucksniveaus von Interaktionen dar. d Ausgewählte Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und verschiedenen T-Zell-Clustern in den Gruppen PBS, Virus@gel und V-Navo@gel. Die Blasengröße stellt den p-Wert dar. Die Farbe stellt den Mittelwert des durchschnittlichen Ausdrucksniveaus von Interaktionen dar.

Als nächstes führten wir eine durchflusszytometrische Analyse und IHC-Färbung durch, um die systemischen Veränderungen der Tumorimmunmikroumgebung zu bestätigen, die wir bei scRNA-seq beobachteten (Abb. 7a). Der Reifegrad der DCs (CD11c+/CD80+/CD86+) in den tumordrainierenden Lymphknoten wurde zunächst durch Durchflusszytometrie analysiert. Bemerkenswert ist, dass V-Navo@gel von allen Gruppen den höchsten Grad an DC-Reifung auslöste (Abb. 7b). Die NK1.1-Färbung der Tumorabschnitte zeigte die erhöhte intratumorale Infiltration von NK-Zellen nach der V-Navo@gel-Behandlung, was mit der scRNA-seq-Analyse übereinstimmt (ergänzende Abbildung 8a). CD8+-Effektor-T-Zellen in Tumorgeweben wurden auch mittels Durchflusszytometrie und Immunfärbung analysiert, da bei der scRNA-seq-Analyse nach V-Navo@gel-Behandlung dramatische Veränderungen in der CD8+-T-Zellpopulation beobachtet wurden. Sowohl FACS als auch Immunfärbung zeigten übereinstimmend, dass V-Navo@gel die Infiltration von CD8+ T-Zellen an der Tumorstelle wirksam förderte (Abb. 7c, d). Darüber hinaus hemmte V-Navo@gel die intratumorale Infiltration von Tregs im Vergleich zur PBS-Gruppe stark (Abb. 7e). Eine weitere Analyse der Tumorlysate zeigte, dass V-Navo@gel die entzündungsfördernden Zytokine (IL12 und IFNγ) und Granzym B, den Marker für aktivierte T-Zellen, an der Tumorstelle erhöhen kann (Abb. 7f), was auf die erhöhte anti-inflammatorische Wirkung hinweist. Tumorimmunreaktionen gegen Tumore. Wir führten außerdem einen Ex-vivo-IFNγ-ELISPOT-Assay unter Verwendung von Milz-T-Zellen durch, um die Bildung tumorspezifischer T-Zellen zu validieren. Unser ELISPOT-Assay zeigte, dass V-Navo@gel antigenspezifische CD8+-T-Zellen robust aktivierte, die gegen Hepa1-6-Zellen erzeugt wurden, was auf die erfolgreiche Erzeugung tumorspezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten hinweist. Dennoch konnten wir die Aktivierung tumorspezifischer CD4+-T-Zellen nicht beobachten, die hauptsächlich bei der Koordinierung der Immunantwort funktionieren und eine starke und anhaltende Aktivierung benötigen, um IFNγ zu produzieren (ergänzende Abbildung 8b). Die RT-PCR-Analyse zeigte auch, dass V-Navo@gel im Vergleich zu PBS oder Virus@gel eine Hochregulierung von CCL2, CXCL10 und CXCL11 induzierte (ergänzende Abbildung 8c). Dieses Ergebnis stützte die GO-Analyse und die CelluloseDB-Analyse in Abb. 6 und legt nahe, dass unser V-Navo@gel die Gene der CCL/CXCL-Familie hochreguliert hat, um eine effizientere T-Zell-Rekrutierung zu ermöglichen. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass V-Navo@gel die Mikroumgebung des Tumorimmunsystems für eine wirksame HCC-Virotherapie umfassend neu programmiert hat.

a Schema der Immunantwortanalyse während des therapeutischen Verfahrens. b Repräsentative FACS-Diagramme (gesteuert auf CD11c+ DC-Zellen) und der Prozentsatz der induzierten DC-Reifung in tumordrainierenden Lymphknoten bei tumortragenden Mäusen mit den angegebenen Behandlungen (n = 6; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). c Repräsentative FACS-Diagramme (auf CD3+-Zellen basierend) und der Prozentsatz der CD8+T-Lymphozyten wurden durch FACS untersucht (n = 6; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). d Repräsentative Bilder der CD4- (rot), CD8- (grün) und DAPI-Färbung (blau) von Tumorabschnitten nach den angegebenen Behandlungen. Maßstabsleiste (obere Reihe): 200 μm. Maßstabsleiste (untere Reihe): 100 μm. e Repräsentative FACS-Diagramme (auf CD4+-Zellen gesteuert) und der Prozentsatz der Tregs-Zellen wurden durch FACS untersucht (n = 6; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). f Zytokinspiegel in Tumorlysaten durch ELISA-Analyse nach den angegebenen Behandlungen (n = 6; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt).

Um das klinische Anwendungspotenzial weiter zu erweitern, untersuchten wir die Antitumorfähigkeit von V-Navo@gel bei weißen Neuseeland-Kaninchen mit implantiertem VX-2-Tumorzell-induziertem Karzinom in der Leber als Großtiermodell (Abb. 8a). Wir haben zunächst gezeigt, dass HSV-1 VX-2-Tumorzellen in vitro erfolgreich infizieren und abtöten kann (ergänzende Abbildung 9a). Wir haben den Zusammenhang zwischen IDO1 und HSV-1 in VX-2-Tumorzellen weiter validiert. Wie in den ergänzenden Abbildungen 9b und c gezeigt, hemmte die Überexpression von IDO1 die HSV-1-Replikation in VX2-Zellen stark, was durch die verringerten Mengen an genomischer DNA und dem gD-Protein angezeigt wird. Navoximod verbesserte konsistent die HSV-1-Replikation in VX-2-Zellen, was durch erhöhte Spiegel der genomischen DNA und des gD-Proteins angezeigt wird (ergänzende Abbildung 9d, e). Diese Ergebnisse bestätigten den Zusammenhang zwischen IDO und HSV-1 in VX-2-Zellen und unterstützen die weiteren In-vivo-Studien am Kaninchen-VX-2-Krebsmodell. Für die In-vivo-Studien wurden VX-2-Tumorgewebe zerkleinert und in den freiliegenden linken Leberlappen des Kaninchens implantiert (Abb. 8b). Nach 12 Tagen, als sich das durchschnittliche Volumen der Tumoren auf 200 mm3 entwickelte, wurden die Kaninchen randomisiert in mit PBS, V-Navo und V-Navo@gel behandelte Gruppen eingeteilt und die therapeutischen Wirkstoffe wurden unter Ultraschallkontrolle in die Tumorstelle injiziert (Abb . 8c). Abbildung 8d zeigt die Ultraschallbilder während des Eingriffs. Das Gewicht der Tiere wurde alle vier Tage überwacht, und wenn der Körpergewichtsverlust einer Gruppe mehr als 20 % überstieg, wurden alle drei Gruppen getötet und die Lebern isoliert, um die Größe und Lage des Tumors zu beurteilen. Ein Kaninchen in der mit PBS behandelten Gruppe starb am 21. Tag. Wie in Abb. 8e gezeigt, zeigten Tiere in der mit PBS behandelten Gruppe den offensichtlichsten Körpergewichtsverlust (über 20 %), während das Körpergewicht der Tiere in V-Navo und V -Navo@gel-behandelte Gruppen blieben nahezu unverändert. Bei der Autopsie zeigten mit V-Navo@gel behandelte Kaninchen im Vergleich zu PBS- und V-Navo-Gruppen die stärkste hemmende Wirkung auf Tumore (Abb. 8f, g). Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das V-Navo@gel eine starke Antitumorwirkung im Kaninchen-VX-2-Leberkrebsmodell zeigte.

ein Schema des therapeutischen Vorgehens. b Das Implantationsverfahren von VX-2-Tumorgewebe in den freigelegten linken Leberlappen des Kaninchens. c Der Injektionsvorgang unter Ultraschallkontrolle. d Die Ultraschallbilder während des Eingriffs. e Gewichtsveränderungen der inokulierten Kaninchen während der gesamten Messung (n = 5; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). f Die Anzahl der metastatischen Knötchen in der Leber von Kaninchen mit den angegebenen Behandlungen (n = 4 in der mit PBS behandelten Gruppe, n = 5 in der mit V-Navo oder V-Navo@gel behandelten Gruppe; Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt). g Bilder von aus Kaninchen isolierten Lebern mit den angegebenen Behandlungen.

Die onkolytische Virotherapie hat großes Potenzial in der Krebsimmuntherapie gezeigt. Es bestehen jedoch immer noch große Herausforderungen, darunter die geringe Fähigkeit der Immuneffektorzellen, in die „kalte“ Immunumgebung des Tumors einzudringen und dort zu funktionieren, sowie die Tatsache, dass der Wirt antivirale Strategien entwickelt hat, um die Virusvermehrung zu begrenzen. Um Lösungen zu finden, wurden mehrere Ansätze beschrieben, darunter der Einbau exogener Gene in die Virusgenome und die Kombination mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren oder der adoptive Transfer von Immuneffektorzellen25,26. Unsere Studie zeigte, dass wir beide Hindernisse durch die Kombination von HSV-1 und dem IDO1-Inhibitor Navoximod überwinden konnten. Es ist seit langem bekannt, dass IDO1 bei Pathogeninfektionen eine entgegengesetzte Rolle spielt, indem es die Replikation von Pathogenen direkt unterdrückt27 oder die T-Zell-Aktivität hemmt28. Kürzlich berichteten zahlreiche Studien über die immunmoderierende Rolle von IDO1 bei TME; Es verursacht eine Anergie von Effektor-T-Zellen und NK-Zellen, indem es Trp-Depletion induziert, und fördert die Treg-Differenzierung durch Kyn-Akkumulation, was letztendlich zur Umgehung des Tumorimmuns führt29,30,31. In unserer Studie haben wir gezeigt, dass die HSV-1-Behandlung auf HCC-Zellen die IDO1-Expression hochreguliert und IDO1 die HSV-1-Replikation in HCC-Zellen als negative Schleife des Immunsystems zur Beseitigung der Viren beeinträchtigt, was den Bedarf an der Hemmung von IDO1 während der HSV-1-Hemmung erhöht. 1-basierte Virotherapie. Die oben genannten Ergebnisse lieferten uns die Begründung für eine Kombinationstherapie aus HSV-1 und IDO1-Inhibitor. In einer anderen Studie wurde außerdem ein onkolytisches Adenovirus, das einen Aktivator von T-Zellen trägt, mit dem IDO1-Inhibitor zur Behandlung von Hirntumoren kombiniert und ein vielversprechendes therapeutisches Ergebnis durch die Umgestaltung der Antitumor-Immunantworten erzielt32. Daher führten wir Experimente durch, um die besten IDO1-Inhibitoren zur Induktion der HSV-1-Replikation auszuwählen, und stellten fest, dass Navoximod im Vergleich zu Indoximod oder Epacadostat unter jedem EC50 die stärkste Wirkung hatte (Abb. 2f und ergänzende Abb. 1g). Darüber hinaus stärkte die Tatsache, dass Navoximod in unserer Gruppe bereits erfolgreich zur Krebstherapie eingesetzt wurde, das Vertrauen in unsere Entscheidung, Navoximod gegenüber anderen IDO-1-Inhibitoren für die kombinatorische HSV-1-Virotherapie zu wählen33. Tatsächlich zeigten die Tiermodelle, dass das mit HSV-1 und Navoximod eingekapselte biokompatible Hydrogel ein großes therapeutisches Potenzial sowohl für primäres HCC als auch für Tumorrezidive zeigte.

Die meisten klinischen Studien zur onkolytischen Virotherapie verwenden wiederholte Dosierungen, um die Virusverteilung an der Tumorstelle zu maximieren, was zu Schwierigkeiten führt, wenn eine intratumorale Injektion erforderlich ist. Hier haben wir eine lokale Abgabestrategie vorgeschlagen, um die Viren in Seidenhydrogele einzubetten. Seidenhydrogele sind ein neuartiges Biomaterial mit umfangreichen Anwendungsmöglichkeiten aufgrund ihrer hervorragenden Biokompatibilität und werden im Bereich Tissue Engineering und Arzneimittelabgabe eingesetzt34. In dieser Studie fungierten die Hydrogele als Depot für die anhaltende Freisetzung der im Tumorgewebe konzentrierten Virionen nach einer Einzeldosis-Injektion. In zahlreichen Studien wurde berichtet, dass verschiedene Arten von Hydrogelen, darunter Seiden-Elastin-ähnliches Hydrogel, Gelatine-Hydrogel usw., zur Einkapselung von Adenoviren für die Antitumor-Virotherapie verwendet wurden35,36,37. Wir haben gezeigt, dass die hier vorgeschlagenen In-situ-Seidenhydrogele HSV-1 an der Tumorstelle begrenzen können, was die intratumorale Virusreplikation weiter induziert und die Infektion peripherer Organe begrenzt. Insgesamt könnte dieses Hydrogelsystem eine nachhaltige Freisetzung und Anreicherung der Virionen an der Tumorstelle bewirken, wodurch es auf andere onkolytische Viren als universelle Verabreichungsplattform für die Virotherapie anwendbar wäre.

Die Analyse der Einzelzell-RNA-Sequenzierung gab Aufschluss über die Immunpopulationen, die in den mit V-Navo@gel behandelten Tumoren vorherrschend waren. Frühere Studien haben auf das verstärkende Potenzial von onkolytischem HSV-1 zur Auslösung von CD8+-T-Zellen hingewiesen38. Die scRNA-Sequenzierung zusammen mit dem folgenden FACS- und Immunfluoreszenz-Assay zeigte, dass V-Navo@gel starke CD8+-T-Zell-Reaktionen erzeugte, was die bewundernswerten therapeutischen Wirkungen gegen Tumore erklärte. Als dominante Antitumor-Effektorzellen wurden auch NK-Zellen nach der V-Navo@gel-Behandlung angereichert. Wir fanden auch einen Anstieg der Gedächtnis-T-Zellpopulation, was mit dem von uns beobachteten Schutz vor einem Wiederauftreten des Tumors übereinstimmte. Laut scRNA-seq-Analyse und FACS wurden DC-Untergruppen auch nach der V-Navo@gel-Behandlung moduliert. Es wurde berichtet, dass cDC1 Antigene sowohl CD4+- als auch CD8+-T-Zellen direkt präsentieren und mit der T-Zell-Immunität synergetisch wirken kann, um eine optimale Antitumorwirksamkeit zu erzielen24. Wir beobachteten, dass V-Navo@gel die Anreicherung der cDC1-Population induzierte, möglicherweise aufgrund der hochregulierten Virusreplikation und Onkolyse, die durch die Kombination von HSV-1 und Navoximod verursacht wurde und anschließend zu einer erhöhten Freisetzung von Tumorantigenen führte.

Zusätzlich zu den Immunzellpopulationen zeigte scRNA-seq außerdem, dass unsere Kombinationstherapie auch die immunsuppressiven Krebszellen durch die Hochregulierung von Chemotaxis-Signalwegen neu programmierte. Die Behandlung mit V-Navo@gel induzierte die Expression von Chemokinen in Krebszellen, einschließlich CCL2, CXCL10 und CXCL11, die die Bildung und Rekrutierung von T-Zellen, B-Zellen und myeloischen Zellen vorantreiben39. Während CCL2, CXCL10 und CXCL11 T-Zellen direkt in die Tumore rekrutieren können, verstärkt CCL2 auch die Rekrutierung von Makrophagen, die anschließend die intratumorale T-Zell-Infiltration erhöhen40,41,42. Tatsächlich ergab die Zell-Zell-Interaktionsanalyse, dass es nach der V-Navo@gel-Behandlung zu mehr Kommunikation zwischen Krebszellen und verschiedenen T-Zell-Clustern über die Paare CCL2/CCR2, CXCL10/CXCR3 und CXCL11/CXCR3 kam, was möglicherweise zu dem Anstieg beiträgt durch V-Navo@gel induzierte intratumorale Infiltration von T-Zellen. Insgesamt hat die scRNA-seq-Analyse dazu beigetragen, eine Umprogrammierung von immunologisch „kalten“ zu „heißen“ Tumoren durch die V-Navo@gel-Behandlung aufzudecken, was die Antitumorimmunität begünstigt.

Gemeinsam haben wir gezeigt, dass HSV-1 und Navoximod als Kombinationsbehandlung über Seidenhydrogele verabreicht werden können, um die therapeutische Wirksamkeit von HCC durch Umgestaltung der immunsuppressiven Tumormikroumgebung zu erleichtern. Darüber hinaus könnte diese Strategie auf andere immuntherapeutische Modalitäten (einschließlich adoptiver Zellen, Immun-Checkpoint-Inhibitoren usw.) als lokalisiertes Reservoir für die Krebstherapie angepasst werden.

Hepa1-6- und HEK293T-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben. VX2-, SMMC7721- und 4T1-Zellen wurden von der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erhalten. Vero-Zellen waren ein Geschenk von Jiahuai Han von der Universität Xiamen. Alle Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (ExCell, China), kultiviert. Alle Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten. Für die vorübergehende Transfektion von IDO1 in den Tumorzelllinien wurde Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Protokollen des Herstellers verwendet.

GFP-HSV-1, das durch Einfügen der GFP-Sequenz in G47delta BAC erzeugt wurde, wurde in allen experimentellen Einstellungen als onkolytische Viren verwendet und in Vero-Zellen vermehrt. Die Titer amplifizierter Viren wurden auf Vero-Zellen mithilfe des Virus-Plaque-Assays wie zuvor beschrieben44 bestimmt. Um die genomischen DNA-Spiegel von HSV-1 zu bestimmen, wurde genomische HSV-1-DNA aus mit HSV-1 infizierten Gewebe- oder Zellkulturproben mit dem TIANamp Genomic DNA Kit (TIANGEN, Deutschland) extrahiert. Anschließend wurde qPCR für die genomische DNA-Analyse von HSV-1 mit den folgenden Primern durchgeführt:

HSV-1 gD: 5'-acgactggacggagattaca-3' und 5'-ggagggcgtacttacaggag-3';

HSV-1 ICP47: 5'-ggtgtggcacatcgaaga-3' und 5'-aacgggtaccggattacg-3'.

Die Bombyx mori-Fibrinlösung wurde gemäß den vorherigen und unseren veröffentlichten Arbeiten mit geringfügigen Änderungen hergestellt18,45. Kurz gesagt, Kokons (5 g) wurden in Stücke geschnitten, 30 Minuten lang in einer Na2CO3-Lösung (20 mM) gekocht und dann dreimal in ddH2O gespült, um Sericinproteine ​​zu entfernen. Extrahiertes Seidenfibroin wurde dann 12 Stunden lang bei 60 °C luftgetrocknet. Anschließend wurde das getrocknete Seidenfibroin 4 Stunden lang bei 60 °C in 9,3 M LiBr-Salzlösung gelöst und dann 72 Stunden lang dialysiert (Mw, 3,5 KDa), um LiBr-Salz zu entfernen. Die erhaltene Seidenfibroinlösung wurde durch Zentrifugation bei 4 °C gereinigt und dann zur weiteren Verwendung bei 4 °C wiederhergestellt. Um Seidenhydrogele mit 2 Gew.-% zu erhalten, wurden Gele hergestellt, indem Seidenlösungen mit 2 Gew.-% entschleimt und mit einer Ultraschallsonde (Scientz-IID, Ningbo Scientz Biotechnology, China) bei 30 % Amplitude für 180 s beschallt wurden. Anschließend wurde die resultierende Lösung bei 37 °C gealtert, um Seidenhydrogele mit 2 Gew.-% zu erhalten. Virus@gel oder V-Navo@gel wurden durch Mischen von 2 Gew.-% Seidenhydrogelen mit dem gleichen Volumen GFP-HSV-1 mit dem angegebenen Virustiter oder dem gleichen Volumen einer Lösung, die HSV-1 und Navoximod enthielt, hergestellt.

Zur Bewertung der rheologischen Eigenschaft wurde Virus@gel (2 × 106 pfu) in ein dynamisches Scherrheometer gegeben, um rheologische Experimente durchzuführen. Der Speichermodul (G') und der Verlustmodul (G") von Virus@gel wurden bei geeigneter Belastung und Belastung gemessen. Zur Bewertung der Quelleigenschaften wurden Seidenhydrogele bzw. Virus@gel in PBS gegeben und das Gewicht jedes einzelnen bestimmt Die Quellung der Gruppe wurde einmal täglich gemessen. Das Quellverhältnis wurde berechnet, indem dieses Gewicht durch das Gewicht der anfänglichen Gele dividiert wurde.

Virus@gel (2 × 106 pfu) wurde in ein Zellsieb mit einer Porengröße von 8 μm gegeben. Das Sieb wurde in eine 24-Well-Platte eingebettet, die mit 1 × 105 Hepa1-6-Zellen kultiviert wurde. Alle 24 Stunden wurde das Sieb zweimal mit PBS gewaschen und in eine andere 24-Well-Platte mit nicht infizierten 1 × 105 Hepa1-6-Zellen eingebettet, während die vorherigen Hepa1-6-Zellen einer Fluoreszenzbildgebung und einer Durchflusszytometrieanalyse unterzogen wurden, um den Prozentsatz zu bestimmen GFP-positive Zellen.

Zur Etablierung subkutaner Hepa1-6-Tumoren wurde ein Inokulum von 3 × 106 murinen Hepa1-6-Zellen in 100 μl sterilem PBS sc in die rechte Achselhöhle von 6 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen injiziert. Zur Etablierung subkutaner 4T1-Tumoren wurde ein Inokulum von 3 × 106 murinen 4T1-Zellen in 100 μl sterilem PBS sc in die rechte Achselhöhle von 6 Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen injiziert. Als die Tumoren eine durchschnittliche Größe von ~100 mm3 erreichten, wurden die Mäuse durch intratumorale Injektion von PBS, 1 × 107 pfu HSV-1, 1 × 107 pfu HSV-1/120 μg Navoximod (V-Navo) in Behandlungsgruppen randomisiert. , 1 × 107 pfu GFP-HSV-1 eingekapselt in 2 % Seiden-Hydrogelen (Virus@gel), 120 μg Navoximod in 2 % Seiden-Gelen (Navo@gel) oder 1 × 107 pfu GFP-HSV-1/120 μg Navoximod in 2 % Seidenhydrogelen (V-Navo@gel). Das Tumorwachstum wurde alle zwei Tage überwacht und das Tumorvolumen (V) wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet:

Dabei sind A und B der längere bzw. kürzere Durchmesser (mm) des Tumors. Das Gesamtüberleben der Mäuse wurde über 40 Tage überwacht und der Endpunkt wurde bestimmt, als der Tumor 1500 mm3 erreichte.

Zur Etablierung eines Tumor-Re-Challenge-Modells wurden HCC-tragende Mäuse vorbereitet und ihnen PBS oder V-Navo@gel gemäß dem oben genannten Protokoll verabreicht. Am 14. Tag wurde eine chirurgische Resektion durchgeführt, um den Primärtumor zu entfernen. Am 17. Tag wurden 3 × 106 Hepa1-6-Zellen in 100 μl sterilem PBS sc in die gegenüberliegende Achselhöhle der Mäuse injiziert. Anschließend wurde die Größe der Re-Challenge-Tumoren alle 2 Tage, bis zu 40 Tage, mit einem Messschieber gemessen.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Review Board (IRB) des Mengchao Hepatobiliary der Fujian Medical University genehmigt und gemäß den Richtlinien der Universität durchgeführt.

Hepa1-6-Tumoren wurden 12 Tage lang intratumoral mit PBS, Virus@gel oder V-Navo@gel (1 × 107 PFU) behandelt. Anschließend wurden die Tumoren dissoziiert und nach der Operation innerhalb von 30 Minuten in der sCelLiveTM Tissue Preservation Solution (Singleron Bio Com, Nanjing, China) auf Eis gelagert. Die Tumore wurden mit 2 ml sCelLiveTM Gewebedissoziationslösung (Singleron) mit dem automatisierten Gewebedissoziationssystem Singleron PythoN® (Singleron) bei 37 °C 15 Minuten lang verdaut. Die Lösung wurde dann 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert und sanft mit PBS suspendiert. Anschließend wurden die Einzelzellsuspensionen (1 × 105 Zellen/ml) mit dem Singleron Matrix® Single Cell Processing System (Singleron) in mikrofluidische Geräte geladen. Anschließend wurden die scRNA-seq-Bibliotheken gemäß dem Protokoll der GEXSCOPE® Single Cell RNA Library Kits (Singleron)46 erstellt. Einzelne Bibliotheken wurden auf 4 nM verdünnt und zur Sequenzierung gepoolt. Zuletzt wurden die Pools auf Illumina novaseq6000 mit 150 bp Paired-End-Reads sequenziert.

Rohe Lesevorgänge wurden mit fastQC und fastP verarbeitet, um Lesevorgänge mit geringer Qualität zu entfernen. Poly-A-Schwänze und Adaptersequenzen wurden von Cutadapt entfernt. Nach der Qualitätskontrolle wurden die Lesevorgänge mithilfe von STAR auf das Referenzgenom mus_musculus_ensembl_92 abgebildet. Genzahlen und UMI-Zahlen wurden mit der featureCounts-Software erfasst. Expressionsmatrixdateien für nachfolgende Analysen wurden basierend auf Genzahlen und UMI-Zahlen erstellt.

Die Zellen wurden nach Genzahlen zwischen 200 und den obersten 2 % der Genzahlen und den obersten 2 % der UMI-Zahlen gefiltert. Zellen mit über 20 % Mitochondriengehalt wurden entfernt und 6000 Zellen pro Probe wurden mit den Teilmengenfunktionen zufällig ausgewählt. Wir haben Funktionen von Seurat v3.1.2 für Dimensionsreduktion und Clustering verwendet47. Die gesamte Genexpression wurde mit NormalizeData und ScaleData normalisiert und skaliert. Die 2000 besten variablen Gene wurden von FindVariableFeautres für die Hauptkomponentenanalyse (PCA) ausgewählt. Die Zellen wurden von FindClusters anhand der 20 wichtigsten Hauptkomponenten getrennt. Der UMAP-Algorithmus wurde angewendet, um Zellen in einem zweidimensionalen Raum zu visualisieren.

Gene, die in mehr als 10 % der Zellen in einem Cluster exprimiert werden und einen durchschnittlichen Logarithmus (Fold Change) von mehr als 0,25 aufweisen, wurden von Seurat v3.1.2 FindMarkers basierend auf dem Wilcox-Likelihood-Ratio-Test mit Standardparametern als DEGs ausgewählt. Anschließend wurde die Zelltypidentität jedes Clusters anhand der Expression kanonischer Marker bestimmt, die in den DEGs gemäß der SynEcoSys-Datenbank oder der vorherigen Literatur gefunden wurden.

Zell-Zell-Wechselwirkungen wurden basierend auf bekannten Ligand-Rezeptor-Paaren von Cellular DB v2.1.0 (https://www.cellphonedb.org/) vorhergesagt. Die Permutationszahl zur Berechnung der Nullverteilung der durchschnittlichen Liganden-Rezeptor-Paar-Expression in randomisierten Zellidentitäten wurde auf 1000 gesetzt. Die individuelle Liganden- oder Rezeptor-Expression wurde durch einen Grenzwert basierend auf der durchschnittlichen logarithmischen Genexpressionsverteilung für alle Gene über jeden Zelltyp hinweg begrenzt. Vorhergesagte Interaktionspaare mit einem p-Wert < 0,05 und einem durchschnittlichen logarithmischen Ausdruck > 0,1 wurden als signifikant angesehen.

Zur Isolierung und Analyse von DCs in vivo wurden Mäuse 8 Tage nach der Behandlung getötet und tumordrainierende Lymphknoten vorsichtig gemahlen und durch 40-μm-Filter filtriert. Anschließend wurden die Zellen mit den entsprechenden Antikörpern angefärbt und durchflusszytometrisch untersucht. Die für die Durchflusszytometrie verwendeten Antikörper sind unten aufgeführt: Anti-CD11c-APC (eBioscience, USA); Anti-CD80-PE (eBioscience, USA); Anti-CD86-PE-Cy7 (eBioscience, USA). Zur Isolierung und Analyse von TILs wurden Mäuse 8 Tage nach der Behandlung getötet und die Tumoren wurden präpariert, gewogen, mechanisch zerkleinert und mit Kollagenase (1 mg/ml, Thermo Fisher Scientific, USA) und Hyaluronidase (0,2 mg/ml, Solarbio, China) behandelt ) und Dnase I (0,02 mg/ml, Sigma-Aldrich, USA) für 2 Stunden bei 37 °C unter kontinuierlichem Rühren. Anschließend wurden die Zellen durch einen 40-μm-Filter geleitet und durch Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugation isoliert, bevor sie mit den entsprechenden Antikörpern angefärbt und durchflusszytometrisch untersucht wurden. Die für die Durchflusszytometrie verwendeten Antikörper sind unten aufgeführt: Anti-CD3-APC (eBioscience, USA), Anti-CD4-FITC (eBioscience, USA) und Anti-CD8-PE (eBioscience, USA) für TILs. Anti-CD25-PerCP-Cy5.5 (eBioscience, USA) und Anti-Foxp3-PE-Cy7 (eBioscience, USA) für Tregs. Zur Isolierung und Analyse von Gedächtnis-T-Zellen wurden Mäuse zum definierten Zeitpunkt getötet und die Milz präpariert. Milzzellen wurden durch einen 40-μm-Filter geleitet und durch Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugation isoliert, bevor sie mit den entsprechenden Antikörpern angefärbt und durchflusszytometrisch untersucht wurden. Die für die Durchflusszytometrie verwendeten Antikörper sind unten aufgeführt: Anti-CD3-APC (eBioscience, USA), Anti-CD4-FITC (eBioscience, USA), Anti-CD8-PE (eBioscience, USA), Anti-CD44-PE-Cy7 (eBioscience, USA) und Anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (eBioscience, USA). Für den Enzyme-linked Immunospot (ELISPOT)-Assay wurden Mäuse 8 Tage nach der Behandlung getötet, die Milz herausgeschnitten und CD8+/CD4+-T-Zellen durch Sortierung isoliert. Anschließend wurden 3 × 104 sortierte Milz-T-Zellen mit 1,5 × 105 Hepa1-6-Zellen kultiviert und die resultierende IFN-γ-Sekretion mit dem ELISPOT-Kit (Mabtech, 3321-4APT-10) nach dem Gerät des Herstellers nachgewiesen.

Am 8. Tag nach der Behandlung wurden Tumore aus Mäusen isoliert. 30 mg Gewebe wurden gesammelt und in RIPA-Lysepuffer (Beyotime Biotechnology, China) lysiert, der Proteaseinhibitor-Cocktails (MedChemExpress, China) enthielt. Die Gewebe wurden mit 5-mm-Magnetkügelchen 6 Minuten lang bei 60 Hz homogenisiert und 5 Minuten lang bei 4 °C und 16.000 g zentrifugiert. Die Überstände wurden mittels ELISA (Boster Biological Technology, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf IFNγ, Granzyme B oder IL12p70 untersucht.

Die Tumoren wurden bei der Tötung am 8. Tag nach den angegebenen Behandlungen gesammelt und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E), Ki67 (R&D System, USA), TUNEL (R&D System, USA) und NK1.1 (ThermoFisher, USA) gefärbt. Tumorschnitte wurden auch einer Immunfluoreszenzfärbung von CD4 und CD8 von Servicebio, China, unterzogen. Wichtige Organe wurden am selben Tag entnommen und einer H&E-Färbung unterzogen.

Es wurden weiße Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von etwa 2,5 kg verwendet. Gefrorenes VX-2-Tumorgewebe wurde aufgetaut, in 1–2 mm3 große Stücke zerkleinert und in den freigelegten linken Mittellappen der Leber implantiert. Um die Ausbreitung der Tumoren zu überwachen, wurde eine Ultraschallbildgebung durchgeführt. Nach 12 Tagen, als sich das durchschnittliche Volumen der Tumoren auf 200 mm3 entwickelte, wurden die Tiere in drei Gruppen randomisiert und jeweils mit PBS, 1 × 109 pfu GFP-HSV-1/2,5 mg Navoximod (V-Navo) oder 1 × 109 intratumoral injiziert pfu GFP-HSV-1/2,5 mg Navoximod in 2 % Seidenhydrogelen (V-Navo@gel). Die Injektionen wurden unter Ultraschallkontrolle durchgeführt. Nach der Behandlung wurde das Gewicht der Tiere alle vier Tage überwacht, und wenn der Verlust des Körpergewichts der Tiere einer Gruppe mehr als 20 % überstieg, wurden alle drei Gruppen getötet und die Lebern abgetrennt.

Zelllysate wurden in RIPA-Lysepuffer (Beyotime Biotechnology, China) hergestellt, der PMSF und einen Proteaseinhibitor-Cocktail (MedChemExpress, China) enthielt, und der Proteingehalt der erzeugten Zelllysate wurde mithilfe des BCA-Proteinassays (TransGen Biotech, China) bestimmt. Aliquots mit 30 μg Gesamtprotein wurden auf SDS-Polyacrylamidgele geladen und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Nachdem die Membranen eine Stunde lang mit 5 % BSA blockiert worden waren, wurden sie über Nacht bei 4 °C mit den angegebenen Primärantikörpern sondiert, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit den HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (Abcam, 1:5000) bei Raumtemperatur. Die primären Antikörper waren wie folgt: gD (21719, Santa Cruz, 1:500), DYKDDDDK-Tag (3P8, Abmart, 1:1000), GAPDH (AB0037, Abways, 1:10000), IDO1 (66528, Proteintech, 1: 1000).

Die Stichprobengröße wurde aus den Ergebnissen einer Vorstudie ermittelt. Die für jedes Experiment verwendete Nummer wird in der Abbildungslegende angezeigt. Mehrere unabhängige Studien bestätigten konsistente Ergebnisse. Die statistische Analyse der Daten erfolgte mittels einseitiger oder zweifacher Varianz (ANOVA) zum Vergleich zwischen mehreren Gruppen oder dem zweiseitigen gepaarten Student-t-Test zum Vergleich zwischen zwei Gruppen. Die Überlebensdaten wurden mit dem Log-Rank-Test (Mantel-Cox) analysiert. *p < 0,05 wurde als statistisch signifikant festgelegt. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Alle Daten wurden mit GraphPad Prism analysiert und als Mittelwert ± SEM über mindestens drei Experimente dargestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten zu dieser Studie wurden in den Artikel und seine Zusatzinformationen aufgenommen. Quelldaten für die Grafiken und Diagramme in den Abbildungen sind als Ergänzungsdaten verfügbar. Bilder von ursprünglichen, nicht zugeschnittenen Western Blots und Gating-Strategien von FACS sind in der ergänzenden Abbildung 10 und der ergänzenden Abbildung 11 enthalten. RNA-seq-Daten wurden in der Genome Sequencing Achieve for Human-Datenbank (https://ngdc.cncb.ac.cn/) hinterlegt. gsa-human/) unter der Zugangsnummer HRA000464. ScRNA-seq-Daten wurden in der Genome Sequencing Achieve-Datenbank (https://hgdc.cncb.ac.cn/gsa) unter der Zugangsnummer CRA008926 hinterlegt. Weitere Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 62175031 an XL und 82103317 an QZ) unterstützt; Projekt des herausragenden Jugendwissenschaftsfonds der Provinz Fujian (2022J06034 an DZ). Natural Science Foundation der Provinz Fujian in China (Grant Nr. 2020J02010 an XL, 2020J011173 an QZ); das Projekt zur Ausbildung junger und mittlerer Talente der Fujian Provincial Health Commission (2020GGA073 bis QZ); Gemeinsame Fonds für die Innovation von Wissenschaft und Technologie der Provinz Fujian (Zuschuss Nr. 2020Y9047 an QZ, 2021Y9216 an DZ); Die wissenschaftliche Stiftung der Gesundheitskommission der Stadt Fuzhou (Zuschuss Nr. 2021-S-wp1 an YZ). Wir danken Weilin Liu vom College of Rehabilitation Medicine der Fujian University of Traditional Chinese Medicine aufrichtig für die Unterstützung beim Aufbau und der Diagnose von Tiermodellen in unserer Studie.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Qiuyu Zhuang, Binyu Zhao.

Das United Innovation of Mengchao Hepatobiliary Technology Key Laboratory der Provinz Fujian, Mengchao Hepatobiliary Hospital der Fujian Medical University, Fuzhou, 350025, VR China

Qiuyu Zhuang, Binyu Zhao, Zhiwen Lin, Yuzhi Liang, Qingfu Zhao, Yunhao Wang, Naishun Liao, Haibin Tu, Youshi Zheng, Yongyi Zeng, Da Zhang und Xiaolong Liu

Mengchao Med-X Center, Fuzhou University, Fuzhou, 350116, VR China

Qiuyu Zhuang, Youshi Zheng, Da Zhang und Xiaolong Liu

Das Leberzentrum der Provinz Fujian, Fujian Medical University, Fuzhou, 350025, VR China

Qiuyu Zhuang, Binyu Zhao, Zhiwen Lin, Yuzhi Liang, Qingfu Zhao, Yunhao Wang, Naishun Liao, Haibin Tu, Youshi Zheng, Hengkai Chen, Yongyi Zeng, Da Zhang und Xiaolong Liu

Das erste angegliederte Krankenhaus der Fujian Medical University, Fuzhou, 350025, VR China

Hengkai Chen & Yongyi Zeng

CAS Key Laboratory of Design and Assembly of Functional Nanostructures, Fujian Institute of Research on the Structure of Matter, Chinese Academy of Sciences, Fuzhou, 350002, VR China

Xiaolong Liu

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F. Zhuang, DZ und XL haben die Studie entworfen. Q. Zhuang, BZ, ZL, YL, Q. Zhao, YW, NL, HT, YZ, DZ und HC führten die Experimente durch. F. Zhuang, BZ, YZ, DZ und XL analysierten die Ergebnisse. F. Zhuang, BZ, YZ, DZ und XL haben das Manuskript geschrieben und überprüft. XL überwachte die Studie.

Korrespondenz mit Da Zhang oder Xiaolong Liu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Yingying Hu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: [Zhijuan Qui und Anam Akhtar]. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhuang, Q., Zhao, B., Lin, Z. et al. Navoximod moduliert die lokale HSV-1-Replikation, um die Immunmikroumgebung des Tumors für eine verbesserte Immuntherapie über ein injizierbares Hydrogel umzugestalten. Commun Biol 6, 621 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04983-z

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Eingegangen: 06. November 2022

Angenommen: 25. Mai 2023

Veröffentlicht: 09. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04983-z

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